CRISPR(Clusterd Regularly Interspaced Short Palindremic Repeat)
규칙적인 간격을 갖고 나타나는 짧은 palindrome의 반복을 말한다. pre-crRNA로 전사된 후 침입한 표적 RNA or DNA를 파괴하는 짧은 RNA로 가공된다.
Cas9
Cas enzyme은 guide RNA와 짝을 이뤄 target DNA의 이중나선을 절단한다. CRISPR system은 기작에 관여하는 Cas 단백질이 여러 개인 경우 class 1, 한 개인 경우 class 2로 분류한다. 두 class는 genome에서의 위치 작용하는 Cas 단백질의 종류에 따라 다시 6가지 type으로 세분화되며 CRISPR-Cas9은 class 2 type II에 해당한다.
Guide RNA
세포 내에서 Cas9 protein과 crRNA가 발현되면 target DNA 서열을 찾기 위한 DNA surveillance complex를 형성한다.
- tracrRNA라는 RNA가 추가적으로 발현되어 crRNA 내 반복 서열과 상보적인 결합을 이룬다. 이때 crRNA, linker, tracrRNA로 구성된 single guide RNA를 사용하여도 효소 활성에 문제가 없다. (linker 부분이 굽어져 traceRNA와 crRNA 서열이 상보적으로 결합)
- guide DNA가 DNA와 상보적인 결합을 형성하고 DNA의 상보적인 서열 근처에 PAM(Protospacer-Adjacent Motif)라는 염기 서열이 있어야만 활성을 가진다.
- Cas9 단백질에는 HNH와 RuvC라는 두 개의 nuclease domain을 가지고 있는데, 목표로 하는 DNA 서열에 Cas9이 결합하면 이 두 도메인이 목표 DNA의 이중 가닥을 각각 한 가닥씩 자르게 된다.
- 절단된 DNA는 DNA repair 기작을 통해 편집이 이뤄진다. 절단된 부위를 단순히 이어붙이는 비상동말단결합(Nonhomologous end joining, NHEJ) 기작으로는 유전자를 녹아웃시킬 수 있고, 상동 재조합(Homologous recombination)의 얼개인 동형방식수선(Homology Directed Repair, HDR)을 통해 유전자 단일 가닥 일부를 없애, dna polymerase와 수선 단백질로 교정하거나 삽입할 수도 있다.